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1. 개요
DNA 시퀀싱(DNA Sequencing)은 DNA의 염기서열을 결정하는 방법이다.2. 소개
DNA 시퀀싱(DNA Sequencing)은 크게 두 가지로 나뉘는데, 샌거 시퀀싱 (Sanger Sequencing)과 차세대 시퀀싱 (Next-Generation Sequencing, NGS)으로 말이다.이 기술은 유전학, 분자생물학, 의학 연구 등에서 필수적인 도구로 사용되며, DNA 시퀀싱 방법은 크게 1세대, 2세대(차세대), 3세대 시퀀싱으로 나눌 수 있다.
2.1. 생어 시퀀싱
우선 생어 시퀀싱은 1977년 프레더릭 생어(Frederick Sanger)에 의해 개발된 방법으로, 최초의 DNA 시퀀싱 기술이다. [1]생어 시퀀싱의 경우 특정 DNA 조각을 시퀀싱하여 SNP를 확인하는 데엔 유용하게 사용되지만, 대규모 분석에는 부적합하다. [2] 때문에 현재는 소규모 유전자 분석에 주로 사용된다.
생어 시퀀싱의 DNA 검출 방법은, 우선 시퀀싱할 DNA 조각을 주형(template)으로 사용하여, 프라이머와 DNA 중합효소를 이용해 복제한다.
그 후, 각 염기(A, T, C, G)에 대해 형광 표지된 디디옥시뉴클레오타이드(ddNTP)를 첨가한다. [3]
DNA 복제 과정에서 ddNTP가 삽입되면 연장이 종료되는데, 이 경우 다양한 길이의 DNA 조각들이 형성되고 이 DNA 조각들을 전기영동을 통해 크기별로 분리한다.
분리된 DNA 조각들을 형광 표지된 ddNTP를 통해 각 염기의 위치를 검출하고, 이를 바탕으로 DNA 서열을 결정한다.
2.2. 차세대 시퀀싱
차세대 시퀀싱 (Next-Generation Sequencing, NGS)는 2000년대 초반에 도입된 기술로, 고속으로 대량 시퀀싱이 가능하다.방법은 다음과 같다.
시퀀싱할 DNA를 짧은 조각으로 절단한 후, 절단된 DNA 조각 양 끝에 어댑터(Adapter)를 결합하여 시퀀싱 준비를 한다.
그 후 DNA 조각을 고정된 표면에서 증폭하여 클러스터를 형성을 하여 각 클러스터에서 염기 서열을 읽는다. 이때 해독 방식은 생어 때와 비슷하게 염기별로 형광 신호를 기록하여 서열을 결정한다.
결정된 서열 데이터를 분석하여 전체 유전체 서열을 조합하고 변이를 탐지하면 된다.
생어보다 훨씬 간단한 방법이기 때문에 빠른 시간 안에 처리할 수 있으며, 비용도 적게 든다.
그리고 차세대 시퀀싱은 여기서 기술이 또 나뉘는데, 대표적으로 Illumina 시퀀싱, Ion Torrent 시퀀싱, Roche 454 시퀀싱 등이 있다.
Illumina 시퀀싱은 해독 길이가 150 ~ 300bp로 짧지만 높은 정확도와 대량 처리 능력을 갖추고 있다는 장점을 가지고 있다.
다음으로 Ion Torrent 시퀀싱은 pH 변화를 감지하여 염기 서열을 결정하는 방식이고, Roche 454 시퀀싱은 Illumina과 대비되게, 해독 길이가 500-700 bp로 길고 정확한 시퀀싱을 제공하지만, 비용이 높다는 단점이 있어서 현재는 많이 사용되지 않는다.
위 같은 단점들을 보완하기 위해 도입된 새로운 시퀀싱 기술이 '3세대 시퀀싱(Third-Generation Sequencing, TGS)'다.
2.3. 3세대 시퀀싱
3세대 시퀀싱(Third-Generation Sequencing, TGS)은 해독 길이가 수천에서 수십만 bp로 매우 길며, 실시간 시퀀싱이 가능하여 복잡한 유전체 분석에 유리해서 현대 시퀀싱을 사용한다고 하면 3세대 주로 방식을 체택한다.이에 대한 원리는 먼저, PacBio 시스템에서 사용되며, 단일 DNA 분자를 실시간으로 시퀀싱한다. 이 과정을 단분자실시간시퀀싱(SMRT)라고 한다.
그 후 DNA 중합효소가 주형 DNA를 복제할 때 형광 표지된 뉴클레오타이드가 삽입되는 것을 실시간으로 감지해서 Oxford Nanopore 기술로 단일 DNA 분자가 나노포어[4]를 통과할 때 전기적 신호 변화를 감지하여 염기 서열을 결정한다.
이를 '나노포어 시퀀싱(Nanopore Sequencing)'이라고 하며, 매우 긴 해독 길이와 빠른 시퀀싱 속도를 제공한다.