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Western blotting.
1. 개요
원하는 단백질을 찾는 데 사용되는 실험 기법이다. 현대 분자생물학에 있어 PCR, ELISA 등과 함께 매우 중요한 실험 기법 중 하나로 자리매김하고 있다. 단백질을 전기영동으로 젤[1]에 분리하여 이를 멤브레인[2]에 복사하듯 옮겨낸 후, 찾고자 하는 단백질에만 특이적으로 반응하는 항체로 검출해내는 것을 골자로 한다.[3] 웨스턴 블로팅은 세포가 발현했을 것으로 추정되는 단백질이 실제로 존재하는지, 있다면 그 양은 얼마나 되는지 검증하기 위해 주로 쓰인다. 현장에서는 보통 웨스턴 블랏, 혹은 더 줄여서 그냥 웨스턴이라고 말한다. 약자로는 WB 혹은 IB로 표기.2. 유래
블로팅이라고 할 때의 그 블롯(blot)을 구글 이미지로 검색하면 잉크 방울 튀는 그림이 잔뜩 나올 것이다. 걸레든 휴지든 간에 모니터를 닦고 싶어지는 충동이 들지 않는가? 블롯은 명사로 "잉크 얼룩"이라는 뜻과 함께 동사로 "얼룩을 빨아들여 닦는다"는 뜻을 가지고 있다.웨스턴 블로팅은 서던 블로팅이라는 DNA를 확인하는 기법이 개발되고 난 이후에 같은 원리를 단백질에 응용시킨 것이다. 휴지와 젤, 멤브레인으로 샌드위치를 만들어 블로팅시켜주면, 즉 밑에서부터 물을 적시면 물이 위로 빨려 올라가 위의 휴지까지 젖게 된다. 이 때 가운데 있는 젤에 그림이 그려있다면 이 그림이 멤브레인에 그대로 복사가 되는 것이다. 맨 처음에 서던 블로팅을 개발한 사람의 이름이 서던이었던 덕에, 이후 개발된 비슷한 방법에 노던, 웨스턴 등 방위 이름이 붙게 되었다. 젤에 DNA 조각이 있었다면 서던 블로팅(남), RNA 조각이 있었다면 노던 블로팅(북), 단백질이 있었다면 웨스턴 블로팅(서)이라고 표현한다.[4][5]
멤브레인에 복사된 단백질은 그 단백질을 항원으로 인식하는 항체로 잡아낸다. 항원-항체 반응은 단백질 간 상호작용 중에서도 강한 결합력을 갖고 있으며 자신의 파트너하고만 결합하려는 성질이 매우 강한 편이므로[6] 원하는 단백질이 있다면 결과가 바로 나오는 편이다.
3. 실험 방법
3.1. SDS-PAGE
세포를 잘 씻은 뒤 껍데기를 까서 단백질을 준비한다. 이 때 발생하는 열이 단백질을 변성[7] 시킬 수 있으므로 얼음 위에서 진행할 것. 원심분리 후 단백질만 따로 모아 SDS-PAGE를 걸어준다.SDS-PAGE는 한천에 비해 뭔가 들어가는 것도 많고 젤 만들려면 준비할 것도 많고, 만드는 법도 복잡하다는 단점이 있다.
3.2. 트랜스퍼(블로팅)
젤로 단백질을 원하는 만큼 분리했다면 "스펀지-종이-젤-멤브레인-종이-스펀지"의 순서로 이쁘게 샌드위치를 만들어PVDF 멤브레인을 사용할 경우 절대 마르게 하지 말고 사용전에 미리 메탄올에 담가 활성화시킨 후 사용하도록 한다.
3.3. 항체 붙이기
멤브레인에 단백질이 잘 이동한 것을 확인하려면 멤브레인을 묽은 아세트산에 폰슈 S(Ponceau S)를 녹인 용액에 담그면 단백질 밴드가 레인별로 잘 보이게 된다. 폰슈 S를 제거하려면 TBS-T로 여러 번 세척해 주면 된다.항체를 희석하는 용액으로는 5% 분유[8]나 BSA(소혈청단백)를 잘 녹인 TBS-T를 사용한다. 항체를 붙이기 전에 위에서 만든 5% skim milk in TBS-T나 1% BSA in TBS-T 용액으로 멤브레인을 블로킹(blocking) 해준다. 블로킹은 멤브레인 상의 빈공간을 메워주어 불특정 항원항체 반응을 줄여주는 역할을 한다.
1차 항체를 위에서 만든 용액으로 잘 희석한다. 희석비율은 항체의 데이터시트(datasheet)를 참조하되 실험자가 직접 최적의 조건을 잡을 것을 권장한다. 1차 항체는 상온에서 3~4시간, 4도씨에서 하루 정도 붙인다. 1차 항체를 붙인 뒤에는 TBS-T로 여러 번 멤브레인을 세척해 주고, 2차 항체를 적당량 희석하여 붙인 후 세척해준다.
1차 항체는 원하는 단백질에 특이적으로 결합하며, 2차 항체는 1차 항체의 꼬리[9]에 특이적으로 결합한다.
3.4. 현상(디벨롭)
2차 항체의 꼬리에는 보통 효소[10]가 표지 되어있는데, 이 효소에 특이적으로 반응하는 시약을 처리하여 가시화 반응이 일어나게 한다. 효소는 기질[11]을 만나 화학적 빛(chemiluminescence)을 내면 과거에는 감광 필름에 현상했었지만[12] 요즘은 디지털영상장치의 발달로 Gel doc[13] 등의 기기로 이미지화 한다. 빛 혹은 색의 진한 정도는 효소의 양에 비례하고, 효소의 양은 단백질의 양에 비교적 비례하기 때문에 밴드의 두께와 밀도를 수치화하면 단백질의 양을 추산할 수 있게 된다.4. 장단점
4.1. 장점
일단 항체를 사용하여 검출하는 방식이다 보니 소량의 단백질만 존재해도 검출하는 것이 가능하다는 이점이 있다. 또한 다양한 종류의 단백질이 섞여 있는 시료를 검사할 때에도 항체의 기질 특이성(substrate specificity) 덕분에 원하는 단백질만 검출 할 수도 있다는 여러가지 다양한 이점이 있다.4.2. 단점
항체가 비싸다. 항체는 기본적으로 토끼, 염소, 쥐 등의 동물에게 검출하고자 하는 단백질의 일부 서열을 주사해서 해당 동물들의 면역체계가 이에 대응하는 항체를 만들면 이놈들의 피를 막 뽑아내서 정제해서 만든다.[14] 과정이 매우 번거롭고 생산량도 적어서 가격이 무지무지 비쌀 수 밖에 없다. 2차 항체가 싸다고[15]는 하지만 이것도 1 mg에 10만원 이상[16] 이다.또한 웨스턴 블로팅은 전체적으로 SDS-PAGE가 젤을 만드는 것부터 해서 전기 영동을 하는 과정도 아가로스 젤보다 복잡하고, 항체를 넣어주는 과정도 두 번이나 존재하기 때문에 상당히 까다롭다.
[1]
보통은 아크릴아미드젤(acrylamide gel)
[2]
일반적으로 니트로셀룰로오스막(nitrocellulose membrane)
[3]
항체로 검출해내기 때문에 웨스턴 블로팅을 단백질 면역 블로팅(protein immunoblotting)이라고도 부른다.
[4]
여기까지가 그나마 메이저한 기법이고, 단백질의 번역 후 수정을 찾는 기법을 이스턴 블로팅(동)이라고 한다. 방위전대 블로팅레인저 업워드 다운워드만 있다면 삼차원 블로팅 완성 더 깊이 들어가자면 DNA와 결합한 단백질을 찾는 사우스웨스턴 블로팅(남서), 하나의 단백질이 아닌 단백질 간의 결합을 확인하는 파 웨스턴 블로팅(극서),
센트럴 도그마에 등장하지 않는 지질, 약물, 호르몬 등을 찾는 파 이스턴 블로팅(극동), DNA로 RNA를 찾는 리버스 노던 블로팅 등등 과학자들이 기법을 개발하는 족족 이름을
적절하게 붙여낸다.
[5]
서던은
서던 블로팅 기법을 개발한 사람 이름이다. 이를테면 최남수 씨가 개발한 실험 기법을 남수법이라고 부르더니 다른 비슷한 기법 이름을 북수법, 동수법, 서수법 등으로 부르는 격. 즉, 그냥 이름으로 장난친거다
[6]
이를 결합 특이적이라고 표현한다. 기질-효소, 리간드-리셉터 결합도 충분히 결합 특이적이지만 항원-항체 결합은 이들을 뛰어넘는다.
[7]
이미 1차 구조로 변성시켰기 때문에 변성의 우려를 가질 필요는 없고, 이보다는 발열에 의한 젤 내 미세 기포의 발생 등으로 밴드의 해상도가 떨어지는 것을 우려하여 냉각을 한다.
[8]
물론 당연히 아기들 먹는 분유를 그대로 쓰는 게 아니다! 트리스(Tris)라는 염기로 완충해놓은 용액에 트윈20(Tween20)라는 시약을 섞은 후(TBS-T) 탈지분유(Skim milk)를 섞은 것.
[9]
항체의 불변 영역 혹은 Fc region이라고도 한다. 항체의 구조는 보통 Y자 형태로 표현하는데 이 때 가변 영역은 두 갈래로 갈라진 Y자의 윗 부분이고, 불변 영역은 Y자의 아래 부분이다.
[10]
HRP(horseradish peroxidase) 혹은 ALP(alkaline phosphatase)
[11]
luminol 계열
[12]
현재는 거의 사용하지 않는 고전 기법
[13]
Gel Documentation system, 차광 상자에 디지털 카메라를 장착한 형태의 기기
#
[14]
Polyclonal abtibody 제조 기법
[15]
수요와 공급의 법칙에 따라 말이다.
[16]
당연히 제조사마다 가격은 천차만별이다.
[17]
정확히는 과정은 쉬우나 번거롭고, 과정이 여러번이기에 문제가 생기면 확인해야 될 부분이 많아 난감하게 된다. 물론 이건 대부분의 생물학 실험들의 특징이다....