1. 개요
顯 微 鏡 / Microscope안경, 망원경 등과 같이 특정 물체를 확대해서 볼 수 있는 기계. 육안으로 확인하기 힘들 정도로 미세한 물체( 미생물, 근육조직이나 세포 등)을 보는 데 쓰는 물건이다.
학교(주로 대학교) 및 연구소, 병원 등지에서 교육・연구・치료 목적으로 사용하고 있다.
2. 기원
여러 문헌에서 자하리아스 얀센(Zacharias Janssen, 1580~1638), 갈릴레오 갈릴레이(Galileo Galilei, 1564~1642), 안토니 판 레이우엔훅(Antonie van Leeuwenhoek, 1631~1723) 등을 현미경의 최초 발명자로 거론한다.1665년에 로버트 훅이 현미경에 근접한 장치를 만들어 처음으로 코르크를 확대 해 보았을 때 그는 벌집 같은 형태를 띤 구조를 관찰하였고 이러한 모양을 수도원의 작은 각방(cell)에 비교했다. 얀센은 렌즈를 처음으로 개발한 사람으로 알려져 있고, 레이우엔훅은 현대의 현미경과 가장 유사한 현미경을 만들어서 미생물을 세상에 최초로 알린 사람이다. 로버트 후크가 코르크를 관찰했을때는 코르크는 살아있는 조직이 아니기 때문에 세포의 핵이나 subcellular structue를 볼 수 없었기에 레이우엔훅이 처음으로 생명체의 세포단위를 본 사람이라고 할 수 있겠다. 얀센이 렌즈를 개발한 지 수십 년이 지난 후 네덜란드의 레이우엔훅은 렌즈를 연마하는 방법과 금속을 세공하는 방법을 익혀, 눈으로 볼 수 없는 작은 물질을 볼 수 있는 현미경을 만들었다. 그가 만든 현미경은 40~270배까지 확대해 볼 수 있었다. 그는 제작한 현미경이 400개가 넘을 정도로 현미경 만드는 일에 빠져들었다. 단순히 무엇을 발명한 사실보다는 그 발명의 영향력을 중시하는 서양인들의 사고방식 때문인지 '현미경의 최초발명자'를 레이우엔훅으로 본다. 이러한 별명을 얻게 된 것은 그가 제작한 현미경이 대물렌즈와 대안렌즈를 이용한 것으로 오늘날의 현미경과 비슷한 모양을 하고 있기 때문이기도 하고, 최초기 때문이기도 하다.
레이우엔훅은 본래 비단 등의 각종 직물을 파는 상인이였는데, 고객들에게 자신이 파는 직물이 품질이 좋은 것임을 증명하기 위해 현미경을 만들었다가 현미경으로 직물 외의 것들을 관찰하기 시작했다. 그는 자신이 만든 현미경으로 냇물이나 빗물과 같은 용액 속에 어떤 물질이 들어 있는지를 관찰하기도 하고, 정자
3. 구조
기본적으로 접안 렌즈, 대물렌즈, 조동나사, 미동나사, 경주(받침대), 재물대 등으로 구성되어 있다.
4. 용어
4.1. 해상도
일반적으로 광학 현미경의 성능을 이야기 할 때 배율로 이야기 하는 경우가 많으나, 이는 일반적인 광학 현미경의 경우이고, 최근 들어 개발되는 레이저를 이용한 scanning 타입의 현미경에서는 scanning 범위에 따라 배율이 변화하기 때문에 주로 해상도를 성능의 지표로 한다. 해상도는 두점이 떨어져 있는 거리를 구별 가능한 능력이라 보면 된다. 시력을 이야기할 때 사용하는 도수를 생각해 보자. 종이에 두 점을 찍어 놓고 멀리 가져가면, 어느 순간부터는 두 점을 구별하지 못하고 한 개의 점으로 보이게 된다. 시력이 좋다는 이야기는 더 멀리서도 이것이 한 개의 점인지 두개의 점인지 구별 가능하다는 의미이다. 이와 마찬가지로 현미경에서도 두 점의 간격이 더 좁더라도 구별 가능한 것을 '해상도가 좋다'라고 표현한다. 일반적으로 해상도는 대물렌즈의 성능(NA: Numerical aperture)에 의해 결정된다. 영상에서 얼마만큼의 넓이를 확대했는가? 라는 지표는 FOV(Field of view)라는 용어로 나타낸다. 영상에서 가로 세로 크기가 얼마나 되는지에 대한 지표이다. 최근에는 주로 디지털화 된 영상을 획득하게 되므로 영상에서의 가로 세로 pixel 사이즈와 FOV, 그리고 해상도의 관계가 매우 중요해진다.예를 들어 해상도가 1μm인 현미경에서 영상을 촬영하였고, 이 영상이 샘플에서 가로세로 300μm의 영역을 촬영한 영상이라고 하자. 이때, pixel 사이즈를 300pixel 이상으로 할 경우 어차피 pixel to pixel 의 거리값이 해상도보다 작아져 버리기 때문에 영상의 질이 더 좋아지지는 않는다. (oversampling) 해상도 떨어지는 사진을 크기만 늘린다고 추가적인 정보를 제공하지 않는 것과 비슷하다. 하지만, 300pixel보다 작은 값으로 촬영할 경우 pixel to pixel 거리가 해상도보다 커지므로 더 많은 정보를 얻을 수 있는데도 놓치게 된다. 현미경을 설계할 때는 이 비율을 잘 설정하는 것이 중요하다.
4.2. NA(Numerical Aperture)
파장과 입자, 이 두 성질을 한번에 가지는 빛은 회절 한계라는 것이 존재한다. 렌즈나 거울을 통해 빛을 한 점에 모아준다고 해서 무조건 작은 크기로 만들 수 있는 것이 아니라, 빛의 파장이나, 기타 조건에 의하여 특정 사이즈 이상으로 작아 질 수 없다. 이때 '기타 조건' 중의 하나가 NA이고 이 값은 다음과 같다.
| [math(\displaystyle {\rm{NA}}=n\sin(\theta) )] |
NA가 클수록 빛을 한 점에 잘 모을 수 있으며, NA를 증대 시키기 위해 구경이 크고 working distance가 작은 렌즈를 쓰거나, 샘플과 렌즈 사이에 물, oil 등의 immersion material을 추가하는 방식을 사용한다.
4.3. 수차
4.4. 광원
현미경은 작은 상을 확대하는 광학기기이다. 이는 상을 확대 하는 과정에서 전체적인 영상이 더 어두워짐을 의미한다. 20배로 확대를 할 경우 면적이 400배로 늘어나고, 그럴 경우 영상의 밝기는 1/400으로 줄어드는 것. 이를 보완하기 위하여 대부분의 광학 현미경은 샘플에 빛을 넣어주는 광원을 추가로 설치하게 된다. 원래는 촛불이나 햇빛을 사용하던 것이 전구의 발달로 인하여 폭발적으로 발전하게 되었다. 하지만, 여전히 문제는 존재 했는데, 전구의 필라멘트가 특정 형상을 띠고 있기 때문에 현미경 사진에서 전구의 필라멘트 형태를 띤 패턴이 검출되는 것. 이를 막기 위해서 간유리(diffuser)를 추가로 설치 하거나, 광학계를 잘 설계 하여 필라맨트의 상이 영상에 맺히지 않도록 조절한 광학계를 추가로 설치하게 된다.최근에는 레이저를 광원으로 사용하는 주사 현미경도 등장하였다.
5. 종류
시료를 어떻게 관찰하느냐에 따라서 광학 현미경과 전자 현미경, 주사탐침 현미경으로 구분된다. 흔히들 광학 현미경을 1세대 현미경, 전자 현미경을 2세대 현미경, 주사탐침 현미경을 3세대 현미경으로 분류하기도 한다.'광학 현미경(optical microscope)',은 빛을 이용하여 시료를 관찰하는 현미경이다. 빛을 관측하는 방식을 기준으로는 일반적으로 반사 또는 투과된 빛을 그대로 관측하는 광학현미경 외에도 편광필터가 추가된 편광 현미경, 빛의 회절현상을 이용하여 투명한 시료의 관찰을 용이하게 한 위상차현미경, 레이저 광원을 이용하여 형광을 띠는 시료의 3차원 구조를 스캔할 수 있는 CLSM등 많은 종류가 있다. 일반적으로 가시광선 영역의 빛을 많이 이용하지만 더 좋은 분해능을 얻기 위해 X선 등 더 짧은 영역의 빛을 사용하기도 한다.
빛 외에 물질을 사용하여 관측을 하는 현미경도 있으며, 전자를 이용하는 '전자 현미경(electron microscope)'이 대표적이다. 주사전자 현미경과 투과전자 현미경으로 구분된다. 고도의 기술이 적용된(즉 아주 비싼) 투과전자 현미경의 경우 아예 탄소 원자를 직접 보는 수준의 배율을 가지고 있다.
주사탐침 현미경(scanning tunneling microscope)은 두 현미경과는 다르게 시료 표면을 더듬는 방법으로 시료 표면을 3차원 적으로 관찰한다. 진공이 아닌 조건에서도 전자 현미경 수준의 높은 배율을 가지고 있으며, 진공조건에서는 그보다도 작은 원자 수준의 관찰도 가능하다.
5.1. 광학 현미경
이 문서 제일 위 그림에 나오는 현미경이다. 보통 사람들이 현미경이라고 하면 이 현미경을 떠올리고 실제로 전공자라도 대학원생이 되기 전엔 이 현미경만 만져보는 일도 허다하다. 현미경의 시초가 바로 이 광학 현미경이고 빛만 있으면 물체를 볼 수 있어서 물체 관찰에 큰 제약이 없다. 다만 전자 현미경과는 다르게 빛으로 물체를 보는 일이기에 사용하는 빛의 파장의 길이 이하의 대상은 관찰할 수 없다. 배율은 1000배 정도가 한계이나 공확대or공배율, 광학 현미경의 일종인 CLSM의 경우 적절한 시료 전처리와 HW/SW적 도움을 통해 5000배 이상의 배율을 가진 것들도 있다.초등학생들도 만지는 현미경이라고 별 기능 없을 줄 아는 사람이 많지만 비싼 건 의외로 기능이 좋아서 멀티 포커스 기능으로 화면전체가 뚜렷하게 보이는 것과 같이 갖가지 신기한 기능이 있다. 종류로는 난자 등의 큰 세포나 매우 작은 생물을 볼 때 쓰는 실체현미경, 위상차를 이용해 입체적으로 볼 수 있는 위상차 현미경, 컴퓨터에 연결해서 보는 usb현미경 등 많다.
유명한 제조사로는 라이카, 올림푸스, 니콘, 자이스 등이 있다.
현미경의 종류는 그 발전 방향에 따라서 여러 가지로 나뉘게 된다. 일반적으로는 현미경은 더 작은 걸 잘 확대만 하면 되지 않느냐. 라고 생각하기 쉽지만, 다양한 요구와 그에 따른 다양한 개발 방향이 존재 하는 것. 해상도가 높은 현미경, 샘플을 절개하지 않고도 안쪽의 영상을 얻을 수 있는 현미경, 해상도는 유지 하면서 더 넓은 영역을 촬영하는 현미경, 촬영 속도가 빠른 현미경, 내가 원하는 특정 물질이나 조직만을 보는 현미경, 생물체를 살아 있는 그대로 촬영 할 수 있는 현미경 등등 수십 가지 요구가 있고, 아래에 나열되는 다양한 현미경들은 그 니즈를 만족시키기 위해 과학자들이 열심히 노력한 결과이다. 모든 걸 만족시키는 데우스엑스마키나는 없으니 내가 원하는 용도에 따라 적절한 현미경을 사용하는 것이 중요하다.
5.1.1. 편광 현미경
일반인이라면 고등학교 지구과학II 시간에 처음보게 되는 현미경일 것이다. 대부분 광물을 박편의 형태로 만들어 관찰하는 용도로 사용한다.현미경의 이름에서 알 수 있듯이 빛의 편광을 이용한다. 빛을 장치를 통해 특정한 방향으로만 진동하게 만들어 재물대 위의 물체를 통과하여 나오는 빛을 보는 것. 현미경마다 작동원리가 조금씩 다르지만 기본적인 작동원리는 다음과 같다. 현미경 제일 아래의 광원에서 나오는 빛을 NS방향의 하부 편광판을 통과하게 만들어 편광시킨다. 이후 재물대 위의 박편을 통과하며 광물의 광학적 특성에 따라 빛의 특성이 달라지게 된다. 이후 이 빛을 직접관찰하게되면 이를 개방니콜이라하며 추가적으로 EW방향의 상부 편광판을 넣어서 관찰하면 이를 직교니콜이라 한다. 개방니콜에서 관찰할 수 있는 현상과 직교니콜에서 관찰할 수 있는 현상이 다르며, 이를 통하여 광물의 특성을 파악한다.
이 밖에도 추가적인 장치를 설치하여 광물의 다양한 특성을 파악하고 있다.
5.1.2. 암시야 현미경
5.1.3. 위상차 현미경 (Phase microscopy)
5.1.3.1. 정량적 위상차 현미경 (Quantitative phase microscopy)
빛의 세기 정보를 이용하는 기존의 위상차 현미경과 달리, 시료를 거친 빛의 "phase delay"를 검출하여 영상화하는 기술로 아직 개발중이다.크게는 두 가지 방법으로 나뉘며, 시료를 투과한 빛을 편광시켜 정보를 얻는 편광법과 시료에 빛을 반사시켜 정보를 얻는 반사법이 있다.
5.1.3.1.1. 편광 위상차 현미경(Polarization phase microscopy)
빛을 면역 형광법으로 태깅한 시료에 투과시키면 세포의 구성에 따라 빛의 굴절율이 달라지는데, 이를 편광시켜 디지털 홀로그래피를 이용해 영상화하는 기술이다.반사법에 비해 측정이 쉽고, 전체적인 신호가 강하다는 장점이 있다.
5.1.3.1.2. 반사 위상차 현미경 (Reflection phase microscopy)
편광법에 비해 좀 더 복잡하지만, 대신 민감도가 100배 가까이 높아 살아있는 세포의 활동을 3차원으로 나노미터 스케일까지 관찰할 수 있다는 것이 장점이다.5.1.4. 간섭 현미경
5.1.5. 형광현미경 (Fluorescence microscopy)
현재 새로이 개발되는 생체현미경의 대부분은 형광을 기반으로 개발되고 있다. 시료에 형광표지를 태깅하여 일정한 파장의 빛을 쪼이면 형광 신호가 검출되며, 이를 통해 특정 분자 혹은 생체조직, 세포의 추적이 유리하기 때문이다.크게 비면역 형광법과 면역 형광법으로 나뉘며, 면역 형광법이 자주 쓰인다.
5.1.5.1. 공초점 현미경(Confocal microscopy)
공초점 현미경에서 '공초점'이란 pinhole을 의미한다. 일반적으로 현미경이나 카메라 같은 광학기기를 사용해 본 사람이라면 초점에서 벗어난 부분의 상은 흐릿하게 나오는 것을 알 수 있다. 이는 빛이 초점에 모이지 않아 상이 흐려지는것이다. 공초점 현미경은 초점 위치에 작은 pinhole(구멍)을 두어 초점에 모이지 않은 빛은 막고, 초점에 맞는 빛만 통과 시킨다. 이로써 깨끗하게 초점이 맞는 상만을 획득하는 기술이 공초점 기술이다. 이 기술의 장점은 기존 광학 현미경과는 다르게 깊이 구분이 가능하다는 것이다. 이 때문에 샘플 안쪽에 초점이 맞춰지더라도 초점이 맞지 않는 신호를 제거하고 초점에 맞는 신호만 받아들여 '투과'가 가능하다는 점. 샘플에 따라 다르지만 생체 샘플이라면 수십~백 마이크로미터 정도의 투과도를 보인다. 이것이 공초점 현미경의 가장 큰 의의라고 할 수 있다. 일전까지의 현미경들은 특정 세포를 관찰하기 위해서 그 세포의 위에 존재하는 다른 세포나 조직들을 모두 걷어내야 했다. 공초점 현미경은 이를 극복한 것이다.광원으로 사용하는 빛의 '반사'를 측정하느냐, 광원에 의해 발행한 '형광'을 측정하느냐에 따라 반사 공초점 현미경과 형광 공초점 현미경으로 구분한다.
공초점 현미경은 한 점 한점의 신호를 획득하기 때문에 2차원 영상을 바로 만들어 내지는 못하기 때문에 일반적으로 XY 축 스케너나 Lens array를 이용하여 2차원 영상으로 재구성한다. 초점을 Z축 방향으로 움직이면서 XY촬영을 하면 이를 3D로 재구성 가능하다
5.1.5.1.1. 공초점 레이저 주사현미경(CLSM)
단일파장 레이저 광원과 핀홀, CCD등의 장치의 도움을 받아 레이저 광원에 의해서 형광을 띠는 시료를 3차원적으로 관찰 할 수 있게 해주는 현미경.레이저 광원은 렌즈와 수직인 위치에서 시료로 조사되며, 이 레이저에 의해 시료 내 형광물질이 발광하면, 이 빛을 이색성 거울이 달린 현미경을 통해서 수집한다. 이러면 평범한 현광현미경과 다를 바가 없지만, CLSM의 현미경부에는 핀홀이라는 것이 존재해서 시료의 한 점에 있는 빛만을 수집한다. 이렇게 해서는 전체 이미지를 알 수 없기 때문에 현미경의 초점은 시료를 2차원 혹은 3차원으로 스캔하고, 이를 재구성하여 이미지를 만들어낸다. 주로 세포를 연구하는 연구실에서 사용한다.
5.1.5.1.2. 반사 공초점 현미경(RCM: Reflectance confocal microscopy)
반사 공초점 현미경은 형광현미경은 아니지만, 공초점 현미경과 원리적으로 비슷하므로 이곳에 표기5.1.5.2. 빛 시트 현미경(LSM: Light sheet microscopy)
5.1.5.2.1. 격자 시트광 현미경(Lattice light-sheet Microscope)
세포내에서 벌어지는 생명현상을 세포 손상 없이 보다 높은 해상도로 관찰할 수 있는 새로운 종류의 현미경.기존 형광현미경에서의 레이저에 의한 시료 손상을 최소화 하기 위해서 시료를 아주 얇고 약한 레이저 시트가 훓게하고, 현미경은 레이저 시트가 지나가는 부분의 형광항체의 빛을 수집한다. 이렇게 함으로서 레이저에 의한 시료 손상이 최소화 할 뿐만 아니라 주변 빛에 의해서 상이 흔들리는것도 최소화 할 수 있다.
개발자인 에릭 베치그(Eric Betzig)는 관련 논문으로 노벨 화학상을 수상하였는데 아기 유모차를 밀다가 떠오른 논문이라고 한다. 근데 당사자는 공돌이라 화학을 전혀 모르지만 원래 물리학을 공부한 것이 분자간의 거리를 어떻게 측정하느냐에 대한 아이디어에 도움이 되어 논문을 낼 수 있었고 그 아이디어를 구현한 PALM[3]이라는 현미경까지의 업적 덕분에 수상했다.
5.2. 전자 현미경
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일단 외부 고리 주사 전자 현미경 분석과 X선 미세 분석을 읽는 것이 이해하기 쉽다는 점을 밝혀둔다.
현미경의 해상력(분해능)은 빛의 파장에 의해서도 결정되는데, 광학 현미경의 가시광선 파장대로는 일정 수준 이상의 해상력을 얻을 수 없다.[4] 그래서 빛 대신 전자를 통해 상을 얻는 현미경이 전자 현미경이다. 전자 현미경은 일상에서 볼 수 있는 양자역학의 산물이라고 할 수 있는데, 전자 현미경이 가용한 이유 자체가 물질파 이론에 의해 전자가 파동성을 갖기 때문이다. 이 전자 간 격차는 당연히 기존 광학 현미경에 사용되는 가시광선 파장보다 매우 짧기 때문에 좋은 전자 현미경의 경우 원자까지 보는 것이 가능하다.
다만 관찰을 위해 세포를 무조건 "고정"시켜야 하는, 달리 말하자면 죽은 세포만 관찰이 가능하다는 단점이 있다. 일반적으로는 세포를 살아있는 상태 그대로 관찰 가능한 광학 현미경[5]에 비해 큰 단점.
크게 주사 전자 현미경(Scanning Electron Microscope, SEM)과 투과 전자 현미경(Transmission Electron Microscope, TEM)으로 나뉜다. 우리가 전자 현미경이라면서 보는 표면 사진은 주사 전자 현미경(SEM)으로 보는 것이다. TEM은 X선 사진과 유사하다 생각하면 된다.
전자빔이 시료에 부딪히면(투과되면) 전자가 원자들과 상호작용을 하면서 2차 전자(SE), 후방 산란 전자(BSE, EBSD, etc.), X선(EDS, WDS, etc), 오제 전자, 음극선 발광(CL), 전자 에너지 손실(EELS, etc) 등 다양한 전자기파와 현상이 나타나게 되며 이들은 전자현미경을 이용한 다양한 분석법에 활용된다. 다만, 전자현미경에서 상술한 현상을 이용해 분석을 수행하려면 사용하는 전자현미경에 해당 신호를 검출할 수 있는 검출기가 장착되어 있어야 한다 [6]. 즉, 전자현미경에는 전자빔에 의해 발생하는 다양한 현상들을 분석하기 위한 장비들이 부착될 수 있으며, 이런 장치들이 많이 부착되어 있는 현미경일수록 현미경 한 대로 다양한 분석을 수행할 수 있고 그만큼 가격도 비싸지게 된다[
( EDS, WDS, WPMA, EELS, AES, BEM(후방 산란 전자 검출기를 장착한 전자 현미경)
여러 종류의 하전 입자
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| 일반 광학 현미경과 전자 현미경의 구조적 차이점 [8] |
유명한 제조사로는 FEI, 자이스, 테스칸, 지올 , 히타치 , 한국에는 코셈이 있다. 과거엔 Leica도 있었다.
여담으로 미국, 독일, 체코, 일본이 전자 현미경 제조 강국이다.
5.2.1. 주사 전자 현미경(SEM)
Scanning Electron Microscope (SEM)의 경우 전자빔을 쏘아 반사된 전자를 관측하는 장비이다. 먼저, 주사 전자 현미경을 이해하기 위해서는 '주사(scanning)'라는 것이 무엇인지 알 필요가 있다. 전자 현미경은 고속으로 방출된 전자의 짧은 파장을 이용하여 보다 높은 분해능을 얻기 위한 장비이지만, 전자기 렌즈의 성능, 그리고 검출기의 집적화 문제 등으로 인하여 일반적인 광학 현미경처럼 '시료에서 반사된 빛(전자)을 렌즈로 모아 상을 맺는다'는 형태로 장비를 만들 수 없다. 때문에 전자는 전자기 렌즈를 통해 상을 맺는 것이 아니라, 전자기 렌즈와 핀홀 등을 통해서 시료의 한 점으로 집중된 전자들의 반사된 정도를 검출기로 수집하여 '시료의 어느 한 점'의 명암을 확인한다. 이 점들을 왼쪽에서 오른쪽으로, 위에서 아래로 하여 시료 전체를 훑으면 시료 모든 표면에 대한 명암 정도를 확인할 수 있다. 이를 '주사(走査)'라고 하며, 이것을 컴퓨터 소프트웨어를 통해 화상으로 바꾸어 출력하는 것이 '주사 전자 현미경'이다.금속과 같은 도체는 전자를 잘 반사해서 밝게 보이고, 전자가 흡수되어도 전도를 통해 곧장 다른 곳으로 빠져나갈 수 있어서 이미지 왜곡이 적게 발생한다. 그러나, 부도체는 전자빔을 쏘면 전자들이 안에 들어가 안나온다. 즉 대전현상(charging)이 발생해 이미지가 왜곡된다. 그래서 부도체 시료를 관찰할 때는 일부러 금속 코팅을 따로 해주는 경우가 많다. 하지만 생물시료나 금속코팅하면 손상을 받는 시료들은 코팅을 할 수 없기 때문에 일반적인 전자현미경으로는 촬영이 어렵다(Os Coating을 하면 데미지를 최대한 감소시킬 수 있다고 한다). 이 경우엔 저진공 SEM 기법을 적용해 볼 수 있다. 경통과 챔버(전자현미경 내부 시료실) 사이의 조리개가 챔버 내부의 가스 분자들이 경통으로 유입되는 것을 방지해주는데 이때 저진공 상태에서 전자빔을 조사하면 전자빔에 의해 가스 분자가 여기(활성화,excitation)되어 다량의 이온과 전자가 발생하며, 이 전하들이 시료 표면에 충전된 전하를 중화시키는 역할을 한다. 따라서 저진공에서는 도전성이 없는 물체에 도전성 코팅을 하지 않고도 선명한 주사전자 현미경 영상을 얻을 수 있어 고진공 환경에서와 비교해 사용자 편의성이 획기적으로 증대된다
전계방출형 주사 전자 현미경(FE-SEM) # #도 있는데[9] 기존의 열전자총을 사용하던 주사 전자 현미경에선 기대할 수 없었던 고배율, 고해상도의 이미지를 얻을 수 있다 [10].
일반적으로 고체의 표면에서 진공으로 전자를 방출시키는 원리는 크게 3가지로 분리할 수 있다.
첫 번째 열에 의해 방출 되는 열전자 방출 #
두 번째 빛에 의해 방출되는 광전자 방출
세 번째 전계 효과에 의해서 전계 방출로 구분된다. #
이 현상으로 발생하는 에너지가 열전자 방출보다 직선적이고 높은 에너지이기 때문에 시료관측할 때 좋다.
https://ko.wikipedia.org/wiki/%ED%84%B0%EB%84%90_%ED%9A%A8%EA%B3%BC
주요 제조회사로는 JEOL (일본), Hitachi (일본), Carl zeiss (독일), FEI (미국), TESCAN (체코) 등이 주로 꼽힌다. 근래에는 대한민국에서도 하나 둘 주사전자현미경 개발에 뛰어들어 새론, 코셈, 엠크래프츠 등의 국내 업체들이 탁상형 소형 주사전자현미경 상용화를 실시하였다.
5.2.2. 투과 전자 현미경(TEM)
Transmission Electron Microscope (TEM)은 1931년 독일의 Max Knoll과 Ernst Ruska에 의해 최초로 개발되었다. 최초의 투과 전자 현미경은 17배 정도로 확대할 수 있을 정도의 분해능을 보였으나, 현재는 개별 원자를 직접 볼 수 있는 50pm 수준에까지 이르렀다.[11] 투과전자현미경은 전통적으로 시료에 수평한 전자빔을 조사하고 시료의 각 부분에 다다른 전자들의 산란차를 이용하여 영상에 활용하는 장치이나, 현대는 전자들을 한 점으로 집속시킨 주사형 투과 전자현미경을 많이 사용하는 추세이다. 일반적으로 투과 전자 현미경에 주사형 투과 전자 현미경 기술을 포함하여 사용한다.투과 전자 현미경은 기본적으로 광학 현미경과 같은 구조를 갖는다. 광학 현미경의 빛과 유리렌즈의 역할을, 전자와 구리코일을 감아서 만든 전자기 렌즈로 대체하면 그 기본 구조가 같다고 볼 수 있다. 대신 빛과는 달리 전자빔이 시료에 까지 도달하기 위해서는 매우 높은 수준의 진공이 필요하며, 실제 진공장치 성능의 비중이 크다.
전자를 사용하는 이유는 가속을 통해 빛보다 짧은 파장을 가진 전자기파를 얻을 수 있기 때문이다. 분해능은 전자기파의 파장에 비례하고 굴절율과 렌즈와 시료간 각도의 sin 함수에 반비례한다.
분해능을 향상시키는데 굴절율과 시료와 렌즈간 각도 조절은 한계가 있는 데 반하여, 전자기파의 파장을 줄이는 것은 보다 용이하다.[12] 전자는 드브로이의 물질파의 특성을 가장 잘 보여주는 입자이다. 전자는 질량이 있으므로 가속을 통해 쉽게 파장을 줄일 수 있다. (p=mv=h/λ) 텡스텐과 같은 일함수가 낮은 물질에서 비교적 쉽게 전자를 뽑아낼 수 있으며, 양극판을 이용하여 전자들을 가속시킬 수가 있다. 현대 재료 연구에 가장 많이 쓰이는 200KeV의 에너지를 갖는 전자는 비상대론적 파장이 2.73pm로 가시광선 중 가장 짧은 보라색 (λ=410nm)보다 15만 배 정도 짧다. (2.73pm*15만=~410nm)
그러나, 실제 투과 전자 현미경은 광학 현미경에 비해서 15만 배가 아닌 약 1000배가 좋은 0.2nm 정도의 분해능을 갖는다. 그 이유는 광학렌즈에 비해서 전자기렌즈의 수차 제어 성능이 뒤떨어지기 때문이다.
이상적인 상황에서는 하나의 점에서 출발한 전자들은 렌즈를 지나서 다시 한 점으로 모인다. 즉 한 점에서 출발한 전자들 중 렌즈의 가장자리를 지나는 것들은 보다 많이 굴절되고, 렌즈 중심을 지나는 것들은 적게 굴절된다. 기하학적으로 한점에서 출발한 전자들은 렌즈를 지나서 다시 한 점으로 수렴한다. 그러나 현실은 전자기렌즈의 가장자리를 지나는 전자는 렌즈에 보다 가까운 쪽에 렌즈 중심 근처를 지나는 전자들은 보다 멀리 수렴하게 되며, 실제 한 점은 렌즈 탓에 원반이 된다. 이를 구면수차라고 부른다.
구면수차 보정 방법은 수학적으로는 이미 해결된 것이었으며, 허블 망원경처럼 광학계에서 먼저 사용되어 왔다. 수차보정기를 장착한 투과 전자 현미경을 수차보정 투과 전자현미경으로 부른다. 주사형 투과 전자 현미경의 분해능을 높이기 위해서는 집속렌즈의 성능을 높일 필요가 있으므로 집속렌즈 쪽에, 수평한 전자빔을 이용하는 투과 전자 현미경 영상을 구현을 위해서는 시료에 의해 산란된 전자들을 모으는 대물렌즈의 성능을 높이기 위해 대물렌즈 쪽에 수차보정기를 부착한다. 집속렌즈와 대물렌즈 양쪽에 수차보정기를 모두 장착할 수도 있지만 (이 경우엔 double Cs corrected TEM이라고 따로 부른다) 이 수차보정기는 굉장히 고가의 장치[13]라서 보통은 안달려 있으며, 수차보정기를 단다고 해도 체감상 성능 향상폭이 큰 집속렌즈 쪽에 수차보정기를 장착하는 것이 일반적이다 [14]
수차보정기의 등장은 특히 ~0.2nm의 수준의 주사형투과전자현미경 분해능을 0.1nm로, 약 절반 정도 향상시켰다. (현재는 0.065nm 정도) 그러나 이러한 차이는 원자를 명확히 볼 수 있느냐 없느냐의 문제로 분해능 향상의 차원의 효과 정도가 아니다. 일반적으로 알려진 투과 전자 현미경 고분해능 영상(High Resolution Electron Microscopy image)은 실제 원자의 영상들이 아니다. 이들은 원자들의 규칙적인 배열 때문에 전자빔이 분화되고, 시료를 빠져 나오면서 서로 간섭하여 만들어진 간접상이다. 실제 원자의 영상은 '주사형 투과 전자 현미경(STEM)'에 의해 가능하며, 수차보정기에 의해 2배 정도로 향상된 분해능은 원자를 관찰할 수 있는 현미경과 아닌 현미경을 가르는 중요한 의미를 가진 수치이다.
빛과는 달리 전자는 시료를 투과할 수 있는 능력이 적어, 투과전자현미경 관찰을 위해서는 전자빔이 투과될 수 있을 정도로 시료를 매우 얇게 썰어내야 한다. 일반적으로 원자영상관찰을 위해서는 20nm 정도의 두께가 필요하며, TEM 관찰을 수행하기 위해서는 시료의 두께를 아무리 못해도 100nm 이하로 얇게 만들어야 한다 [15].
투과전자현미경으로 금속 시편을 관찰하는 경우, 자신이 관찰하려고 하는 시편이 자성을 띠고 있는지 반드시 알고 있어야 하며, 만약 분석 의뢰를 맡기는 경우 시료에 자성이 있음을 오퍼레이터에게 미리 알려야 한다. 투과전자현미경의 대물렌즈는 자기장 렌즈로 되어 있는데, 이 렌즈의 구조가 자기장이 시편을 투과하는 형태로 되어 있다. 즉, 투과전자현미경으로 시편을 관찰하게 되면 시료가 자기장에 노출되며, 강자성체 금속의 경우 이 자기장에 의해 자화되어 시편이 자성을 띠게 만들어버린다. 시편이 자성을 띠게 되면 시편에 형성된 자기장이 전자에도 영향을 미쳐서 이미지를 왜곡시키기 때문에 수차를 틀어지게 만드는 건 기본이고 정말 최악의 경우엔 시편이 자기장 때문에 시편 홀더에서 떨어져 나와서 대물렌즈에 붙어버릴 수도 있다. 이렇게 물리적 버그가 발생하면 오퍼레이터 입장에선 정말 골치가 아파진다. 장비를 분해하고 시편을 찾아내서 제거해야 하는데, 이 과정이 아주 골치 아프며 보통 엔지니어를 불러서 처리해야 하는데 그러면 적어도 몇 주 동안은 장비를 못쓴다 보면 된다. 그러니 자성이 있는 소재를 분석해야 하는 경우엔 특히 주의해서 분석을 수행해야 한다.
주요 제조 회사로는 JEOL (일본), Hitachi (일본), FEI (Thermo Fisher[16] Scientific 산하 / 미국) 등이 있다. 최근 사용하는 TEM은 수십억대를 호가하는 상당히 고가의 장비이다.
5.2.3. 광전자 융합 현미경
한국표준과학연구원 관련 뉴스한국표준과학연구원의 보도자료 하단의 hwp파일을 다운받으면 된다.
5.3. 주사 탐침 현미경(Scanning Probe Microscope, SPM)
전자 현미경과는 다르게 매우 작은 탐침(Probe)를 이용하여 시료의 표면을 관측하는 장비로, 현미경의 분류 안에서는 그 역사가 가장 짧다. 탐침을 주사한다는 의미에서는 같으나 관측하는 방식에 따라 크게 주사 터널링 현미경(Scanning Tunneling Microscope, STM)과 원자간 힘 현미경(Atomic Force Microscope, AFM. 줄여서 원자현미경이라고 칭하는 경우도 종종 있다)으로 나뉜다.5.3.1. 주사 터널링 현미경(STM)
Scanning Tunneling Microscope (STM)은 바이어스 전압이 걸린 탐침을 시료 표면 위로 움직여 전자 터널링 현상에 의한 터널링 전류를 읽는다. 탐침과 시료 사이에서 일정한 전류가 흐르도록 실시간으로 탐침의 Z축 위치를 조정하기 때문에, 탐침과 표면 사이의 거리가 가까워지면 전류가 급증하는 것을 이용해 표면의 모양을 그릴 수 있다. 단일 원자 수준의 크기를 관찰 가능하지만, 충분한 양의 전류가 흐르는 도체 물질만 측정 가능하다.STM은 기본적으로 전자의 분포를 보는 것이기 때문에, 전자가 비편재화된 경우 원자가 뚜렷하게 보이는 대신 전자 분포가 보인다. 대표적인 경우가 그래핀.
5.3.2. 원자간 힘 현미경(AFM)
Atomic Force Microscope (AFM)은 주사 터널링 현미경이 도체에만 적용가능한 것과 달리, 부도체에도 사용할 수 있으며 대기 중이라면 온도를 크게 타지 않고, 심지어는 용액 속에서도 측정이 가능하다[17]. 일반적으로 분해능은 STM보다 비교적 떨어지지만, 복잡한 장비와 초고진공 조건을 요구하는 STM과 달리 간단한 구조로 가격이 비교적 저렴하면서도, 다양한 시료에서 사용이 가능하기 때문에 많은 연구에서 사용되어지고 있다.측정모드로는 현미경의 캔틸레버(Cantilever)[18]에 달린 매우 작은 팁[19]이 표면과 매우 밀접한 채로(0.5nm 이하) 물체간 발생하는 척력 또는 마찰력을 활용해 측정하는 Contact mode, 그보다 조금 먼 상태(0.5~2nm)에서 현미경 팁의 고유 진동수 변화를 통해 측정하는 Tapping mode, 팁과 원자 간의 반 데르 발스 힘을 이용하여 측정하는 Non-contact mode가 있다. 현대에는 일반적으로는 Tapping mode가 가장 많이 이용되지만[20] 목적에 따라 모드를 달리할 수 있다. 현대에 들어 전자현미경과 함께 가장 많이 이용되고
주요 제조 회사로는 Asylum Research (영국), Nanosurf (스위스),
[1]
그리스도교 주류의 보수적인 당시 사회 특성상 수음이 아니라 아내와의 자연스러운 관계에서 채집된 물건이란 사실을 실제로 무척 강조했다.
[2]
근데 이걸 다루는 건 정말 철저한 문과 두뇌가 아닌 이상 수업만 잘 듣고 3번만 해보면 능숙해진다. 물론
프레파라트를 잘못 만들면 그런거 없다 가끔씩 프레파라트가 막장인데 자기가 현미경 다루는 솜씨가 부족해서 초점이 안 맞는 줄 아는 경우가 있는데, 현미경 다루는 것 자체는 정말정말 쉬우니 초점이 안 잡힐 경우 프레파라트를 먼저 의심해보자.
[3]
Photo-activated localization microscopy, 플래시를 연속적으로 터트리듯이 시료에 광자를 조금씩 뿌리고, 이로 인해서 형광항체에서 나온 광자를 CCD로 수집, 누적된 데이터를 바탕으로 하여 기존 현미경의 회절한계를 넘어서는 분해능을 구현한 형광 현미경
[4]
가시광선 광원을 사용하는 광학현미경으로 달성할 수 있는 이론상 최대 분해능은 XY면(예를 들면 서로 떨어진 두 점의 구분)에 대해 약 200nm이며, z축 방향(예를 들면 표면 요철의 구분)의 경우 약 500nm 이다.
[5]
광학 현미경이라도 종류에 따라 세포를 고정시켜야 할 수 있다.
[6]
상술한 현상 설명 항목에서 괄호 안에 기술된 영문 약자가 해당 현상을 활용한 분석 기법명이다.
[7]
디텍터 가격이 정말 많이 비싸고 설치 가격마저 상상을 초월할 정도로 비싸다. 디텍터 종류와 성능에 따라 가격이 달라지지만 일반적으로는 싸도 수 백만원, 쓸만한 수준의 디텍터들은 수 천만원 ~ 수 억원을 호가한다. 장치 설치비는 고가 디텍터의 경우 국산차 신차 한 대 값이 나오는 경우도 있다
[8]
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[9]
링크의 이론과 개념을 모르면 전자 현미경의 원리를 알 수가 없다. 일단 전자 현미경들은 전자총에 에너지를 가해주고 진공을 잘 유지시켜야 하니까... 백열전구 생각하면 되지 않을까? 백열전구는 오히려 열전자총과 원리가 동일하다. 열전자총은 필라멘트를 가열해서 발생하는 전자를 가속시키는 방식으로 전자빔을 형성한다. 반면 전계방출형 전자총은 고진공 환경에서 금속에 강력한 전기장을 인가해서
터널링 효과에 의해 외부로 방출되는 전자를 가속시켜 전자빔을 형성시키기 때문에 백열전구와는 작동 메커니즘이 전혀 다르며, 작동시키면 뜨겁게 달궈지는 백열전구랑 다르게 전계방출형 전자총은 실온에서 동작한다
[10]
열전자총 SEM은 보통 4만배 이상 확대하면 이미지 화질이 눈에 띄게 떨어지는 반면, FE-SEM은 세팅만 잘 해주면 10만배 이상 확대해도 선명한 화질이 유지된다
[11]
미국의 TEAM project, 2009년
[12]
시료과 렌즈간 각도는, 쉽게 말하자면 더 잘 보기 위해서는 더 가까이 다가가야 하는데, 이 경우 눈과 보는 지점 간의 각도는 더 커지게 된다.
[13]
수차보정기만 해서 10억 정도 한다
[14]
일반 TEM 이미지는 수차보정기 안달려 있어도 정대축만 잘 맞추면 lattice fringe를 관찰할 수 있지만, STEM 이미지의 경우는 수차보정기가 안달려 있으면 원자는 고사하고 격자구조도 관찰하기 힘들다.
[15]
그래서 TEM 시편은 SEM 시편에 비해 전처리 준비 난이도가 훨씬 더 높다
[16]
영상
[17]
1980년대 노벨 물리학자 Gerd Binnig가 AFM이 개발되기 전, 여러 STM을 개조하여 진공대신 용액을 이용해 석묵 (graphite) 및 실리콘 크리스탈의 원자 사진(Atomic Resolution)을 찍은걸로 꽤 유명하다. 이 순간이 AFM 개발의 이론적 계기이기도 하다.
[18]
갯수당 가격이 5만원 (재질이나 코팅, 모양새 또는 타입에 따라 가격이 천차만별이다) 이 넘을정도로 한번 실수하면 그대로 날려먹는 매우 값진 소모품이다.
[19]
이론적으론 팁 끝이 원자 하나(Single Atom)이다.
[20]
분해능과 상의 명확도가 높으면서도 시료에 잔존하는 수분 등을 제거하면서 관측하는 것이 가능하다. Contact 모드는 분해능은 높으나 상의 명확도가 낮고, 심지어 시료와 팁의 파괴도 또 한 이중에서 제일 크다. Non-Contact 모드는 상 자체는 명확하게 보이나 분해능이 비교적 낮은 편이다. 또한 두 모드 모두 수분의 영향을 많이 받는 편이다.
[21]
Park Scientific Instruments를 인수한 회사로, Bruker에 합병되었다
[22]
최근에 실시간으로 SEM 촬영이 가능한 복합형 AFM 기기를 생산해내었다!
[23]
창업자이자 CEO인 박상일 박사는 AFM 을 초창기에 개발한 스탠포드 대학 캘빈 퀘이트 (Calvin Quate) 교수가 이끌었던 연구진 출신으로, 세계 최초로 상업적 (commercial) AFM을 판매한 Park Scientific Instruments를 미국에서 창업 후 매각하였다. 이후 한국에서 다시 창업한 회사가 바로 Park Systems로, 기존의 사명 또한 PSI의 후속 격이라는 의미에서 Park Scientific Instruments Advanced의 약자인 PSIA를 사용하였었다. 기술적으로는 타 회사의 제품에서는 구현된 바가 없는 True Non-Contact Mode가 유명하다.
[24]
원래 초창기 AFM은 STM에 부속품들을 부착하여 만들어졌기에, 초창기 AFM에는 원래 있던 기능이라고 볼 수 있다.
[9]
링크의 이론과 개념을 모르면 전자 현미경의 원리를 알 수가 없다.